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细胞原代培养和传代培养
细胞原代培养和传代培养
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
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最后更新:2019-10-17半年访问:242
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(一)原理

细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来,广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域,发展成一种重要生物技术,并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短,性状与体内相似,适用于研究。一般说来,幼稚状态的组织和细胞,如:动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

(二)操作

1.取材

用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后,把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒,取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤,剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。

2.切割

用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次,然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎,直到成1mm3左右的小块,再用PBS清洗,洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中,静置数分钟,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。

3.消化、接种培养

吸取0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液1ml,加入离心管中,与组织块混匀后,加上管口塞子,37℃水浴中消化8~10分钟,每隔几分钟摇动一下试管,使组织与消化液充分接触,静止,吸去上清,向离心管中加入5~10ml含5%小牛血清的MEM培养基,用吸管吹打混匀,移入二个培养瓶中,置于二氧化碳培养箱中培养。

(三)结果

细胞接种后一般几小时内就能贴壁,并开始生长,如接种的细胞密度适宜,5天到一周即可形成单层。

传代细胞培养

(一)原理

体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代,以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞,并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后,由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭,将培养的细胞分散,从容器中取出,以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养,即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间,与细胞世代或倍增不同。在一代中,细胞培增3~6次。细胞传代后,一般经过三个阶段:游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度,即细胞群的分裂相数/100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2%~0.5%,肿瘤细胞可达3~5%。细胞接种2~3天分裂增殖旺盛,是活力最好时期,称指数增生期(对数生长期),适宜进行各种试验。

(二)操作

1.将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液,加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜),静置5~10分钟。

2.在倒置镜下观察被消化的细胞,如果细胞变园,相互之间不再连接成片,这时应立即

在超净台中将消化液倒掉,加入3~5ml新鲜培养液,吹打,制成细胞悬液。

3.将细胞悬液吸出2ml左右,加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液,盖好瓶塞,送回二氧化碳培养箱中,继续进行培养。

(三)结果

一般情况,传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2~4天就可在瓶内形成单层,需要再次进行传代。

三、器材及液体的准备和无菌操作的注意事项

(一)器材和液体的准备

细胞培养用的玻璃器材,如:培养瓶、吸管等在清洗干净以后,装在铝盒和铁筒中,120℃,2小时干烤灭菌后备用;手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅,20分钟蒸气灭菌;MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。

(二)无菌操作中的注意事项

在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。为此,在操作前要认真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分钟起动超净台吹风。操作时,严禁说话,严禁用手直接拿无菌的物品,如瓶塞等,而要用器械,如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞,打开之前用乙醇将瓶口消毒,打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下,打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后,加上瓶塞,才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端,将尖端在火上烧一下,戴上胶皮乳头,然后再去吸取液体。总之,在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

 

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