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免疫组化实验技术对外服务
免疫组化实验技术对外服务
免疫组化是应用抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究
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最后更新:2019-8-20半年访问:117
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免疫组化实验技术对外服务

简介:             

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化的分类:
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
免疫组化主要步骤
1.   洗载玻片:   将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。
2.  包埋组织:   先在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐,再将塑料模具盒盖上,最后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。
3.   切片:    将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致,然后调节切片的厚度,一般为5µm,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4.  捞组织:   当组织载玻片置于40°C温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37°C温箱中烘干。
5.   脱蜡:   依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6.  抗原修复:  脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7. 血清封闭:   冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍(900µlPBS:100µl血清封闭液)。
8.  加一抗:   将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
9.  加二抗:   将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
10. 加SABC:    将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11. 加显色剂:  将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)   A:DAB        B:H2O2        C:磷酸缓冲液
12.  复染:   将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。
13.  脱水:将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。
14.  封片:  用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。

免疫组化的相关试剂:

最重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗,注意抗体的特异性、效价和交叉反应,最好用单抗。
其他常用试剂有:
1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),稀释抗体和洗片子用;
2、清洁液、纯水,洗玻片用
3、多聚赖氨酸处理载玻片,防止脱片
4、固定液:4%多聚甲醛或冷丙酮等;
5、15%~30%蔗糖,组织脱水用;
6、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,或者OCT包埋做冰冻切片;
7、抗原修复液:枸橼酸缓冲液(pH6.0);
8、活化剂:EDTA或者Triton X-100;
9、1%~10%牛血清清蛋白(BSA)封闭液;
10、H2O2,灭活内源性过氧化物酶;
11、显色液:根据你做的酶来选择,如果是HRP就用DAB,如果是AKP,就用NBT/BCIP,免疫荧光则不需要;
12、50%缓冲甘油封片液。
 

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