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如何选择合适的浓缩离心管?
点击次数:5281 发布日期:2017-8-15  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
一提起蛋白质浓缩、更换缓冲液,我们都会想起超滤。这是一种我们都很熟悉的膜分离技术。它可用来分离溶液中极小的颗粒和溶解的分子。这种方法的最大特点是操作简便,只需要浓缩离心管和离心机,即可圆满完成我们的任务。
 
与层析、透析等方法相比,超滤对被处理的分子更加温和。它不需要有机萃取,就不会导致蛋白变性。这种方法非常高效,可同时浓缩和纯化分子。操作可在低温(比如冷库)下进行。另外,快速、便宜,也是许多人青睐它的原因。
 
浓缩离心管的操作很简单。选择适当的浓缩离心管,加入待处理的样本,按照离心管的指示进行离心操作,最后回收截留的样本。在离心力的作用下,溶液中的小分子溶质和溶剂透过超滤膜,被收集在滤过液收集瓶中,而大分子溶质被超滤膜截留在浓缩离心管中。这种分离的主要依据是分子大小,但分子形状和电荷等其他因素也会有影响。
 
一般来说,超滤的回收率可达90%以上。样本损失大多是由于滤膜表面和容器表面的非特异性吸附引起的。因此,选择口碑好、高品质的浓缩离心管非常重要。Pall作为过滤方面的老牌公司,提供了多种浓缩离心管,可对50 μl到60 ml的样本进行高效的浓缩和脱盐。它配备了Omega(改良的聚醚砜)膜,确保低的非特异性吸附和高的回收率。当然,这个的前提是你选对了浓缩离心管。
 
如何选择浓缩离心管
1. 按体积
Pall提供了4个系列的浓缩离心管,适合处理不同体积的样本。你可以根据你的样本量来选择。不过,如果样本浓度低体积大,可以选择较小容积的浓缩离心管多次重复加样离心。

产品
样本体积
Nanosep® 浓缩离心管
< 0.5 mL
Microsep™ Advance 浓缩离心管
0.5-5.0 mL
Macrosep® Advance 浓缩离心管
5-20 mL
Jumbosep™ 浓缩离心管
20-60 mL

2. 选择适当的截留分子量(MWCO)
 
一旦样本体积确定,下一步就是选择适当的MWCO。对于蛋白质而言,建议所选滤膜的MWCO是欲截留分子大小的1/6-1/3。通常,截留孔径越小,流速越慢,但截留比例更大。因此,如果流速是主要的考虑因素,建议选择MWCO为1/3的滤膜;如果重点考虑截留比例,那么最好选择更致密的膜。
友情提示一下,超滤膜对分子的截留是由多个因素决定的。在截留分子量之外,你还有必要考虑分子形状、电荷、样本浓度、样本组成及操作条件。也许,线性的DNA分子溜走了,而球状的分子却被保留下来。总之,根据下表来选择MWCO就基本没错了。为了防止大家拿错管子,Pall还贴心地将不同MWCO的浓缩离心管设置成不同的颜色,以方便识别。
核酸应用的MWCO选择

MWCO
碱基对(双链)
碱基(单链)
3K
16-32 bp
32-65 bs
5K
25-50 bp
50-95 bs
10K
50-145 bp
95-285 bs
30K
145-285 bp
285-570 bs
50K
240-475 bp
475-950 bs
100K
475-1450 bp
950-2900 bs
300K
1450-2900 bp
2900-5700 bs
1000K
4800-9500 bp
> 9500 bs

蛋白应用的MWCO选择

MWCO
膜额定的孔径大小
生物分子的大小
生物分子的分子量
3K
-
-
10K-20K
5K
-
-
15K-30K
10K
-
-
30K-90K
30K
-
-
90K-180K
50K
5 nm
15-30 nm
150K-300K
100K
10 nm
30-90 nm
300K-900K
300K
35 nm
90-200 nm
900K-1800K
1000K
100 nm
300-600 nm
> 3000K

浓缩离心管的应用
 
浓缩
 
这是大家都很熟悉的应用。超滤可很方便地浓缩经过稀释的蛋白质或DNA/RNA样本。它很温和,不会打断长达100 kb的DNA,也不会导致蛋白酶活的损失,同时也很高效,回收率通常高于90%。
 
之前,美国McGuire VA medical Center的Katrina Stumpf曾与我们分享了她使用Microsep浓缩离心管的经验。她利用这些装置来浓缩一种小肽。操作过程中,她发现甘油了影响浓缩。之后,她先使用MWCO较大的装置,接着将滤过液加到MWCO较小的装置上。虽然耗时长一些,但是顺利完成了浓缩任务。她认为Microsep浓缩离心管简便易用,操作手册详细,信息量大。
 
脱盐和缓冲液交换
 
超滤带来了一种方便而高效的方法,可去除和交换溶液中的盐、去除变性剂、分离复合分子、去除低分子量组分,或者快速改变离子或者pH环境。比如在用两种或两种以上的限制性内切酶进行酶切时,有时找不到通用的酶切缓冲液,就可以借助浓缩离心管,更换缓冲液。
 
组分分离
 
当然,超滤无法完全分离两种分子量接近的分子。为了有效分离,待分离分子的分子量至少要相差一个数量级(10X)。对于PCR产物的纯化和回收,超滤就很适合。PCR反应混合物里含有多种盐、游离的核酸、甘油、蛋白和引物,因此大多数的下游应用都要求对PCR产物进行某种纯化。超滤的方法快速,操作少,产率高,也不损伤DNA。
最后提醒一下,浓缩离心管是一次性的工具,不建议重复使用。不过,由于价格不便宜,有些研究人员也尝试重复使用。他们的经验是,用于同一样本,至少两次没问题,用完之后用蒸馏水冲洗一下,并保存在20%的酒精中。不过,这只是个人经验,仅供参考哦。(

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