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Western blotting之样品制备注意事项
点击次数:1729 发布日期:2019-5-7  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

无论你是处理细胞还是组织样本,蛋白提取都是一个很艰难的过程。要么使用物理方法将细胞破碎或者使用化学试剂处理细胞进行裂解。如果第一步提取就搞砸的话,那么长时间小心翼翼培养的细胞就会完全浪费。这里有一些建议可以帮助你进行样品的抽提。

头号公敌:蛋白酶
无论您选择哪种提取方法,蛋白酶都将是一个主要的关注点。当你需要的时候,蛋白酶是很有用的,但是如果你不需要,它们会在短时间内降解目标蛋白。在细胞被胰蛋白酶消化后,在裂解前彻底清洗去除所有的胰蛋白酶。同样的道理也适用于组织,在溶解前要彻底清洗,以清除残留的血液,其中也含有蛋白酶。清洗之后细胞是干净的,准备裂解,要添加蛋白酶抑制剂到裂解缓冲液中。使用蛋白酶抑制剂,并保持样本在冰上,以防止蛋白降解。如果研究的是磷酸化蛋白,也可以添加磷酸酶抑制剂。
 
物理vs.化学方法破碎细胞
物理裂解方法包括超声、均质、反复冻融和机械破碎(研磨、切碎和碾压)。当不想把化学和酶引入到提取系统中,物理裂解是理想的。然而,专业设备的要求往往会使过程不一致,难以扩大规模,成本过高。由于物理方法有关的压力和温度很高,因此还必须小心避免蛋白变性和聚集。在整个过程中,把所有的东西都预先冷却,并保持样品的低温状态。
如果您无法使用物理方法裂解细胞,请不要担心。有很多抽提试剂可以帮助提取蛋白。试剂裂解法因其操作简便、蛋白提取量高、稳定性好、价格低廉等优点而日益受到人们的欢迎。试剂裂解法的主要缺点是一些盐和去垢剂等干扰下游分析。如果进行蛋白功能研究,在选择缓冲液和去垢剂时需要谨慎。

Apexbio蛋白的抽提试剂

去垢剂的选择
如果抽提的样品量大,添加SDS和其他离子去垢剂到你的缓冲液将是你最好的选择。对于Western blotting,使用含有SDS的缓冲液是理想的,例如1X RIPA,因为它在溶解细胞蛋白方面非常有效。如果蛋白需要在其天然构象中正常发挥作用,最好使用温和的提取方法,使用非离子去垢剂,如NP-40或Triton X-100。
浓度测定:最后,使用Bradford、BCA或Lowry进行蛋白的测定,进行蛋白的等量上样。

来源:北京深蓝云生物科技有限公司
联系电话:010-57256059
E-mail:info@cycloudbio.com

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