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胖纸的福音! 敲除Zfp217基因可通过RNA m6A带走你腰间的“救生圈”
点击次数:1558 发布日期:2019-6-13  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
“拜拜,甜甜圈,珍珠奶茶方便面!火锅米饭大盘鸡,拿走拿走别客气!”肥胖赶走,健康就有,RNA甲基化终于对脂肪分化下手。脂肪形成与分化的相关基因已经不是秘密,减脂塑身保持身材也是我们的终极目的,可脂肪分化过程中的转录后修饰是如何调控的(di)?这一次我们聊聊Zfp217基因敲除如何通过RNA m6A甲基化“燃烧你的卡路里”!
m6A甲基化做为重要的转录后修饰,在各种病例、生理过程当中都扮演了重要角色,影响mRNA稳定性、成熟、可变剪切,改变mRNA蛋白翻译效率,影响miRNA成熟等等,“万金油”般的存在让RNA m6A甲基化修饰备受瞩目。但大多数RNA m6A的故事开端都是从酶开始,到靶点分子终止,这些甲基化相关的酶通过影响下游靶点甲基化水平的高低而间接改变细胞表型。但这次不一样,故事起源于成脂分化(adipogenic differentiation)相关的重要基因Zfp217(zinc finger protein,锌指蛋白),恰巧这一功能高度相关的蛋白能直接和FTO、YTHDF2等甲基化重要蛋白相互作用,从而大范围引起表观转录组的改变,这篇文章也发表在著名的Nucleic Acid Research(11.9分)杂志上,云序生物带你看看这次不直接干预甲基化酶也能发甲基化高分文章的科研故事是如何叙述的。
发表期刊:Nucleic Acid Research
影响因子:11.9
实验方法:MeRIP-seq RNA-seq MeRIP-qPCR Co-IP ChIP-qPCR
原文链接:Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and post-transcriptional regulation to promote adipogenic differentiation (doi: 10.1093/nar/gkz312)

图1:Zfp217介导mRNA m6A修饰调控转录和转录后修饰从而促进成脂分化
阴影部分是本文亮点(红色标记实验部分,云序提供一站式服务)
1.Zfp217敲除明显阻滞脂肪分化
在3T3L1细胞中,无论是siRNA的方式还是CRISPR/Cas9敲除Zfp217,都能看到脂肪形成受到了明显的阻滞,相关的重要基因如PPARγ、P2、LPL等的表达都发生了明显下调。Zpf217的缺失明显造成了脂肪形成受阻。

图2:Zfp217敲除后脂肪分化相关基因表达明显下调
2.Zfp217敲除随之带来的是广泛的m6A修饰水平上升
m6A修饰整体水平检测(云序可提供此服务)结果证明,m6A修饰在Zfp217敲除的细胞当中有广泛的上升,并且这种上升发生在敲除的早期而不是在细胞诱导培养2天后。

图3:整体水平的mRNA m6A检测
3.RNA-seq结合MeRIP-seq探索Zfp217的分子机制
Zfp217敲除之后进行RNA-seq测序(云序可提供此服务),同野生型比较结果显示1431个基因发生上调,941个基因发生下调,其中GO分析表明下调基因大部分和细胞周期、RNA加工以及脂质生物合成相关,表明Zfp217有可能正向参与脂质体代谢和RNA的加工过程。

图4:RNA-seq的数据整理和GO分析结果
Merip-seq/m6A RNA甲基化测序(云序可提供此服务)在对照和Zfp217敲除的3T3L1细胞当中进行比较可以看到,motif分析和经典的GGACU基序保持一致,且m6A位点多存在于5’UTR以及3’UTR区域,差异甲基化区域个数为3332个,由于甲基化差异都发生在0天而不是2天,证明甲基化水平的改变是依赖Zfp217的,且Zfp217敲除或许可以抑制细胞的增殖并促进凋亡。细胞周期相关的基因出自现在RNA-seq的数据当中,但并没有出现在MeRIP-seqRNA-seq的联合分析(云序可提供此服务)数据当中,暗示细胞周期不是主要的和Zfp217敲除后m6A改变最为相关的生物学功能。

图5:MeRIP-seq RNA-seq联合分析
当然其他的一些关键基因,如Ccdc141(Up)、Efcab11、Hspa1a进行qPCR以及MeRIP-qPCR(云序可提供此服务)的验证,验证结果均与测序结果保持一致。数据表明Zfp217能够正向调控分化脂肪分化相关的重要基因。

图6:MeRIP-qPCR和qPCR验证
4.亮点:Zfp217和YTHDF2相互作用保持FTO去甲基化酶活性
在肿瘤当中的研究证明Zfp217可以和其他蛋白能结合发挥功能,此时用带标签的过表达细胞株HEK293T细胞进行IP实验,令人失望的是Co-IP(云序可提供此服务)的结果当中没有找到我们熟知的FTO,ALKBH5以及METTL3/4这些明星甲基化酶,但是在3T3L1当中作者成功的用Co-IP的方式证明了YTHDF2和Zfp217相互结合,这种结合不依赖于RNA。细胞定位结果表明两种蛋白均在核内核外广泛分布,但是Zfp217在核外的分布要多于核内部分,激光共聚焦表明YTHDF2和Zfp217共定位表明两者有可能协同发挥生物学功能。

图7:亚细胞定位显示YTHDF2和Zfp217在细中共定位
因为之前有报道YTHDF2可以通过在热压力(heat stress)下抑制FTO活性而维持m6A修饰水平,正如预期,Zfp217正是打破这一平衡的关键因素,Zfp217的过表达可以解除YTHDF2对FTO的抑制作用,进而使细胞的状态偏向去甲基化方向。Zfp217不与RNA结合,反而打乱YTHDF2的定位从而回补FTO的去甲基化能力。

5.亮点:Zfp217能直接充当转录因子激活FTO的转录
因为Zfp217有8个C2H2锌指结构域以及一个转移活化域,联合生信分析与ChIP-qPCR(云序可提供此服务)结果,作者发现Zfp217确实是一个具有转录因子活性的蛋白,可以结合FTO的启动子区域对靶基因的转录活性进行调节,这里面FTO就是下游靶基因之一。

图8:FTO TSS上游结合Zfp217
长期关注甲基化酶让我们的视野受限,不妨仔细看看这篇文章。RNA甲基化研究到现在,科研人员已经真正的习惯了人工直接干预甲基化相关的Writer,Eraser和Writer来看细胞表型,倘若不直接对这些明星分子进行敲除或者过表达,还有没有其他思路?这篇文章就是最好的模板,Co-IP的方式寻找直接活间接和这些明星蛋白结合的蛋白,寻找那些功能强大的上游分子进行研究,将会是接下来RNA甲基化研究的另一个重要方向。
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