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云序客户Nat Com重磅成果丨miR-27a在结核病中机制研究新发现
点击次数:1366 发布日期:2019-6-20  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
文章导读
结核病(TB,Tuberculosis)是结核杆菌(Mtb,Mycobacterium tuberculosis)感染导致的疾病。根据感染部位不同分为肺结核、淋巴结核、骨骼结核等,这是一种发病率较高、传染性较强的疾病。据世界卫生组织统计,2016年全球范围内有1040万新病例并且有170万死亡。
云序客户同济大学医学院、附属上海市肺科医院戈宝学教授实验室长期从事围绕肺结核预防和诊治开展基础和临床转化医学研究,通过在我司做的miRNA测序不久前发表文章报道了新结核病的易感基因,为结核病的诊断和治疗提供了新的理论基础。
发表期刊:Nature Communications
影响因子:12.35
实验方法:miRNA测序
文章内容
1. Mtb诱导miR-27a表达
为探索结核菌感染发病新机制,作者分别对正常人和肺结核患者外周血、结核菌感染的小鼠不同时间点的肺组织、巨噬细胞进行miRNA测序(云序提供此服务),分析结果发现结核菌感染会显著上调 miR-27a的表达。
图1. Mtb诱导miR-27a表达
2.miR-27a通过抑制细胞自噬促进Mtb在细胞内的存活
那miR-27a的高表达对Mtb有什么作用呢?作者接下来分别用miR-27a-M(miR-27a的模拟物)和miR-27a-I(miR-27a的抑制剂)处理感染Mtb的巨噬细胞,然后在不同时间点进行菌落形成单位(CFU)的检测,从而判断Mtb在细胞内的存活情况。结果显示miR-27a-M能显著促进Mtb在细胞内的存活,相反miR-27a-I能显著抑制Mtb在细胞内的存活。
前人研究表明,Mtb在细胞内的存活受自噬控制,而LC3-I向LC3-II的转化与自噬体的形成有关,并且这种转化是自噬的关键标志物。miR-27a的过表达显著降低了LC3-II的量,而miR-27a的抑制剂增加了LC3-II的量。为了进一步验证miR-27a通过自噬对Mtb发挥作用,作者使用mRFPGFP染料,监测LC3标志物在细胞内自噬情况:黄色非自噬,红色自噬。在感染Mtb的巨噬细胞中,miR-27a-M显著抑制自噬体的形成,而miR-27a-I加速自噬体成熟。当巨噬细胞中miR-27a的基因缺失时,LC3-II和自噬体的量升高。以上证据都表明miR-27a通过抑制细胞自噬的发生从而促进胞内Mtb的存活。
图2. miR-27a通过抑制自噬促进Mtb在细胞内的存活
3.miR-27a增强细胞对Mtb的易感性
为了评估miR-27a在体内TB发病机制中的功能作用,作者分别用Mtb的 H37Rv菌株去感染WT小鼠或miR-27a 缺失的小鼠,28天后检测组织病理学损伤,结果发现在WT小鼠的肺组织中Mtb感染强烈,但是miR-27a缺失的小鼠的肺中的Mtb感染较少。
通过调节miRNA的表达,从而促进宿主的先天防御是研发针对TB的新型治疗最有前景的方式。为了研究miR-27a的抑制是否可以转化为宿主定向疗法(HDT),作者使用miR-27a antagomir(miR-27a抑制剂)在小鼠Mtb感染模型中抑制miR-27a并测试其治疗功效,结果证明了该抑制剂对小鼠模型中Mtb感染有治疗效果。
    
图3. miR-27a增强细胞对Mtb的易感性
miR-27a抑制剂对Mtb感染有治疗效果
4.miR-27a直接靶向于Cacna2d3
miR-27a通过什么方式抑制细胞自噬从而促进胞内Mtb的存活的呢?作者使用碱基互补配对的方法,发现一系列miR-27a的潜在靶标,作者选择Cacna2d3(Cac3)进行下一步研究。Cacna2d3的3'-UTR中具有miR-27a的特异性结合位点,为了确认Cacna2d3是否是miR-27a的直接靶标,我们进行了Cacna2d3的野生型(WT)和突变型(mut)的荧光素酶实验,发现miR-27a可以直接与Cacna2d3的3'-UTR结合从而抑制Cacna2d3的表达。同样的,在感染Mtb的小鼠巨噬细胞和来自TB患者的PBMC中,Cacna2d3的mRNA水平也很低。随后作者分别检测miR-27a-M和miR-27a-I处理后的Cacna2d3表达量,同样发现两者之间存在负相关的关系。且在沉默miR-27a后,Cacna2d3表达量随时间增加。以上证据都表明,miR-27a可以直接与Cacna2d3结合从而抑制Cacna2d3的表达。
图4. miR-27a直接与Cacna2d3结合抑制Cacna2d3的表达
5.Cacna2d3通过促进细胞自噬降低Mtb在细胞内的存活
为了研究Cacna2d3在Mtb感染中的作用,作者进行了CFU分析,以了解其对巨噬细胞中Mtb在细胞内存活的影响。首先,作者在体外用siRNA沉默Cacna2d3,发现Mtb活力显著增加。接着作者又进行了体内实验,引入了Cacna2d3突变小鼠,同样发现巨噬细胞中Mtb在细胞内存活增加。透射电子显微镜(TEM)分析显示,与WT细胞相比,在缺失Cacna2d3的巨噬细胞中积累了相对更多的细菌。当用Mtb感染时,缺失Cacna2d3的巨噬细胞中LC3-II的量同样减少。共聚焦显微镜分析显示,通过siRNA或PB抑制对Cacna2d3的抑制显著降低了细胞自噬。这些结果表明Cacna2d3可能通过促进自噬从而降低Mtb在细胞内的存活率。
图5. Cacna2d3通过促进细胞自噬降低Mtb在细胞内的存活
6.miR-27a通过Cacna2d3和Ca2 +调节Mtb在细胞内的存活率
为了确定miR-27a是否通过靶向Cacna2d3来调节Mtb在细胞内存活,作者分别用miR-27a-M和miR-27a-I转染WT和Cacna2d3缺失的巨噬细胞,然后用Mtb感染24小时。结果发现miR-27a-M转染后显著增加了WT巨噬细胞中Mtb的细菌存活率,但对Cacna2d3缺失的巨噬细胞中Mtb细菌存活率无影响。同样的,miR-27a-I?显著降低WT巨噬细胞中Mtb的细菌存活率,但不显著降低Cacna2d3缺失的巨噬细胞中Mtb细菌存活率。共聚焦显微镜分析显示,miR-27a-M抑制WT巨噬细胞中LC3斑点(自噬体特征)的形成,而miR-27a-I促进了WT巨噬细胞中LC3斑点的形成。同样,它们对Cacna2d3缺失的巨噬细胞中LC3斑点形成的无显著影响。这些结果表明miR-27a可能通过靶向Cacna2d3来抑制自噬从而促进Mtb在细胞内的存活率。此外,作者针对miR-27a的另外两个候选靶标Plk2和St6galnac3也做了相应的研究,发现它们也能增加miR-27a缺失后巨噬细胞中Mtb的细胞内存活率,所有这些结果表明miR-27a可以同时靶向多个转录物,对Mtb生存力有效累积效应。

图6. miR-27a通过Cacna2d3调节Mtb在细胞内的存活率
接下来作者又检查了miR-27a是否通过Ca2 +信号传导调节Mtb在细胞内的存活率。转染?miR-27a-M显著抑制Mtb诱导的Ca 2+流入,而转染miR-27a-I?显著增强Ca 2+流入。类似地,在对Mtb感染的反应中,与WT巨噬细胞相比,miR-27a缺失的巨噬细胞能显著增强Ca 2+流入。与WT巨噬细胞相比,用Ca2 +抑制剂BPD预处理miR-27a缺失的巨噬细胞,Mtb存活率没有降低。在用BPD预处理的miR-27a缺失的巨噬细胞中也未发现LC3斑点的形成有显著增。这些结果表明,miR-27a可能通过下调Ca2 +信号传导促进Mtb的存活。
为了研究miR-27a与Cacna2d3在体内的相关性,分别用Mtb感染WT和Cacna2d3缺失的小鼠14天,然后每3天用一次NC抗肿瘤药和miR-27a抑制剂治疗14天。然后对感染小鼠的肺进行H&E染色。发现miR-27A抗肿瘤药治疗可减轻病理损害,抗酸染色和CFU分析显示,Mtb感染的WT小鼠肺内细菌滴度明显降低,而Mtb感染Cacna2d3缺失的小鼠则无明显变化,提示miR-27a可能通过体内靶向Cacna2d3调节Mtb的存活。

图7. miR-27a通过Ca2 +信号传导调节Mtb在细胞内的存活率
总结
为探索结核菌感染发病新机制,戈宝学教授团队通过对Mtb感染的巨噬细胞、小鼠以及结核病人的样本进行miRNA测序分析,发现结核菌感染会显著上调 miR-27a的表达。miR-27a能显著抑制细胞自噬的发生从而促进胞内结核菌的存活并加重结核菌感染发病。进一步的研究发现,miR-27a靶向内质网表面的离子通道Cacna2d3 并抑制了Cacna2d3基因的表达,从而损坏了宿主细胞钙信号通路和细胞自噬途径以促进了结核菌的存活和感染发病。最后,miR-27a的抑制剂的使用能够有效地减轻结核分枝杆菌感染引起的肺部病理损伤,以及降低肺部荷菌量。该研究不仅揭示了结核菌通过诱导宿主细胞的miRNA 来抑制钙信号介导的自噬的免疫逃避新途径从而为结核病的诊断和治疗提供新的理论基础,同时,miR-27a的抑制剂作为一种新型的抗结核药物已经在开发研究中。
 
通讯作者简介
本文通讯作者是同济大学医学院附属上海市肺科医院戈宝学教授。戈宝学教授于1999年获美国加州大学遗传学博士学位。1999-2002年期间,在美国SCRIPPS研究所作博士后,2002年获中科院百人计划引进到中科院上海生科院任课题组长,2011年起任同济大学特聘教授,博导,医学院院长助理,上海市结核病(肺)重点实验室主任,同济大学附属上海市肺科医院转化医学研究中心主任,973项目首席科学家。先后获得国家基金委杰出青年基金,第一届谈家桢生命科学创新奖,教育部长江学者特聘教授。
戈教授主要研究感染免疫中的信号转导调控机制,在Science、 Nature Immunology,、Cell Host & Microbe、 PLOS Pathogens,、JI,、JBC,、Cellular Signaling 等国际著名杂志上发表研究论文四十多篇。目前担任法国MICROBES & INFECTION 杂志编委。上海市肺科医院研究实习员刘峰博士,转化医学中心助理研究员陈建霞以及结核科主治医师王鹏为该论文的共同第一作者。在戈宝学教授的带领下,该实验室长期从事围绕肺结核预防和诊治开展基础和临床转化医学研究。
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