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重组蛋白表达系统
点击次数:1151 发布日期:2019-7-8  来源:卡梅德生物科技(天津)有限公司
重组蛋白表达系统
 
选择合适的蛋白表达系统是重组蛋白成功表达的关键。需要考虑以下方面的因素,包括:目标蛋白性质、用途、蛋白质产量和成本。此外,许多蛋白质表达项目也存在着风险,尤其是大蛋白、膜蛋白、核蛋白和具有大量翻译后修饰的蛋白质。
目前卡梅德生物可以提供几种表达系统可供客户选择,不同的系统有不同的特性和应用。在这里,我们将介绍四种常用于研究和工业级别的表达系统。即:细菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统和哺乳动物表达系统。
 
1. 原核表达系统
大肠杆菌表达系统是最主要也是最成熟的表达系统。主要方法是将目标DNA片段导入宿主细胞。然后用IPTG诱导蛋白表达。
大肠杆菌表达系统作为最早开发和应用最广泛的经典表达系统,具有遗传背景清晰、选育快、成本低、表达量高、产品纯化容易、稳定性好、抗污染能力强、应用范围广等优点。然而,在原核表达系统中也存在许多缺点:例如并非所有的蛋白质都是可溶的。细胞质中错误折叠的蛋白质能形成称为包涵体的不溶性聚集物,这导致了蛋白难以纯化。此外,原核表达系统的翻译后修饰过程不完善,表达产物的生物活性较低。
因此,其他更复杂的系统也正在开发中;这些系统可能允许以前认为在大肠杆菌中不可能表达的蛋白质的表达,例如糖基化蛋白质。
2. 酵母表达系统

酵母表达系统作为一种新的外源蛋白表达系统,具有原核和真核表达系统的优点。它在基因工程领域得到了广泛的应用。1996年对酿酒酵母全基因序列进行了测序。酿酒和面包行业使用酿酒酵母已有数千年的历史,被认为是不产生毒素的GRAS(一般公认为安全的)生物,也被FDA认可。因此,酵母系统表达的产物不需要进行大量的宿主安全性实验。然而,与新的酵母系统相比,酿酒酵母表达系统不适合于高密度培养,缺乏强有力和严格的调控启动子。分泌效率低。尤其是分子量大于30kD的许多靶蛋白几乎不分泌。
后来,人们开发了裂变酵母和甲醇酵母表达系统。其中,甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统。目前,甲醇酵母主要有H多晶型、博迪念珠菌和毕赤酵母。毕赤酵母是最受欢迎的工具。大多数甲醇酵母含有甲醇酵母氧化酶基因-1(AOX1),外源基因在启动子(paox1)作用下表达,PAOX1是以葡萄糖或甘油为碳源的强启动子,AOX1基因在甲醇酵母中的表达通常受到抑制。当甲醇为唯一碳源时,PAOX1可以被活化,因此,在该基因的控制下,AOX1基因的表达可以增加。利用甲醇酵母来表达外源蛋白的产量通常可达到克级别。与酿酒酵母相比,其翻译更接近哺乳动物细胞,不发生高糖基化。
 
3. 昆虫杆状病毒表达系统
昆虫表达系统是一种广泛应用的真核表达系统,具有翻译和修饰类似于高等真核生物的外来蛋白质的能力。重组杆状病毒在昆虫细胞系统中表达外源蛋白是一种较为流行的表达方法。蛋白质含量可达1~500mg/L,但受到培养基、供氧量、对数生长等多种因素的限制和影响。
杆状病毒是已知的昆虫病毒中最大的一类,是最早、研究最多、最适用的昆虫病毒。杆状病毒基因组是一个80-160kb大小的单封闭环状双链DNA分子。它的基因组可以在昆虫的细胞核中复制和转录。DNA复制被组装在杆状病毒的树皮中,具有很大的灵活性,可以容纳大量的外来DNA插入片段。它是表达DNA大片段的理想载体。
杆状病毒系统的主要优点包括:
* 重组蛋白具有蛋白质正确折叠和二硫键等完整的生物学功能;
* 翻译后的修饰;
* 高表达水平,高达总蛋白量的50%;
* 适应大片段插入蛋白;
* 可同时表达多种基因。
主要的缺点是外源性蛋白表达受到病毒启动子的控制较缓慢,使得细胞由于病毒感染而开始死亡。
昆虫表达系统通常用于膜蛋白的生产,尽管糖基化可能与脊椎动物中发现的不同。一般来说,使用它比使用哺乳动物病毒更安全,因为它的宿主范围有限,不经修饰就不会感染脊椎动物。
 
4. 哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞中表达的重组蛋白通常使用质粒转染和病毒载体感染。稳定的质粒转染细胞株需要数周甚至数月的时间,而病毒载体可以在几天内迅速感染细胞。
根据蛋白质表达的时空差异,表达系统可分为瞬时表达系统、稳定表达系统和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在没有选择压力和外源载体的情况下,随着细胞分裂而使得表达逐渐丧失。靶蛋白表达持续时间短。瞬态表达系统的优点是实验周期短、简单。稳定的表达系统意味着载体DNA在宿主细胞内长时间稳定的复制和表达。由于选择阻力和压力步骤的需要,稳定表达相对耗时费力。诱导表达系统是指靶基因在外来小分子诱导下开始表达。使用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记可以增加蛋白质的产量。
哺乳动物表达系统在蛋白质起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特的优势,适用于表达完整的大分子。
哺乳动物细胞产生的外源蛋白,与天然蛋白相近,其活性远远高于原核生物表达系统或酵母、昆虫等真核表达系统产生的蛋白质。该技术的缺点是工艺复杂、要求高、产量低,有时还存在病毒感染。

所有这些表达系统都有优缺点。大肠杆菌和酵母表达系统的优点是表达水平高、成本低,但它们的修饰系统不同于昆虫细胞和哺乳动物细胞;哺乳动物细胞产生的蛋白质与天然蛋白质相似,但缺点是表达水平低,操作复杂。不同表达系统产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时因翻译后加工的转移而不同。因此,在考虑选择哪一种表达系统时,需要考虑多种因素,如靶蛋白是否具有毒性、蛋白是否需要生物活性、蛋白是否需要糖基化以及成本效益、产量、纯化、安全性等。
 
表1 四种表达系统的简单比较
  原核表达系统 酵母表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物表达系统
速度 ★★★★ ★★★ ★★
产量 ★★★ ★★★★ ★★
PTM
(相对于人)
★★ ★★★ ★★★★
价格 ★★ ★★★★ ★★★
应用 原核蛋白,简单真核蛋白 分泌蛋白、二硫键合蛋白、糖基化蛋白 膜蛋白、大分子量蛋白、病毒疫苗、信号蛋白、细胞因子、激酶 复杂的真核蛋白、质需要精确的PTM蛋白

 
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