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RNA乙酰化——m6A热点之后RNA修饰新方向
点击次数:239 发布日期:2019-8-5  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
​文章导读
“表观转录组学”的概念是通过转录后修饰影响RNA的结构和功能,是近几年来生物学科里热门的研究领域之一,目前已知的天然RNA修饰类型超过150种,之前我们已经介绍很多关于m6A、m5C、m1A和m7G的相关内容。目前,ac4C RNA乙酰化修饰作为一类新型RNA修饰,是继m6A修饰之后又一表观转录组学热点和“超级潜力股”!
ac4C RNA乙酰化是在RNA ac4C修饰酶的作用下,使N4位乙酰胞嘧啶发生乙酰化的一种保守的化学修饰(N4-acetylcytidine)。早期研究发现该修饰存在于真核生物中丝氨酸及亮氨酸tRNA和18S rRNA上,导致Watson-Crick碱基配合鸟苷的热稳定性增加,调控蛋白合成中的编码准确性;近期研究发现ac4C广泛分布在人类转录组中,大多数位点出现在编码序列(CDS)内,并且通过改善的mRNA稳定性和翻译促进靶基因表达。
今天小编为大家解析一篇Cell发表的关于ac4C RNA修饰的文章,希望能给大家带来收获!
美国国家癌症研究所(NCI)和弗雷德里克国家实验室探究发表了ac4C的文章,并将该成果发表在了国际顶级期刊Cell(影响因子=36.22)中。该研究,发现下调NAT10(RNA去乙酰化酶)能够抑制Hela细胞的增殖;并且下调NAT10后,mRNA ac4C的总体水平下降;为了进一步探究mRNA ac4C修饰的特点,作者对WT和下调NAT10的Hela细胞进行acRIP-seqRNA-seq(云序生物提供此项服务),发现ac4C 的peak主要富集在mRNA的CDS区,且与靶mRNA的下调有很大关系;这预示着ac4C可能与mRNA的翻译相关,作者从mRNA稳定性和翻译效率着手探究,发现ac4C乙酰化修饰通过延长mRNA的半衰期促进mRNA的稳定性;通过ac4C peak中的密码子偏好性促进mRNA翻译效率。这些发现不仅扩大了mRNA修饰范围(包括乙酰化残基),也确立了ac4C在mRNA翻译调控中的作用。

原文链接:https://www.sci-hub.shop/10.1016/j.cell.2018.10.030
发表期刊:Cell
影响因子:36.22
实验方法:acRIP-seq、RNA-seq
技术线路

注:云序提供acRIP-seq和RNA-seq服务
文章内容
(1)NAT10的功能探究
1)NAT10的细胞层面和分子层面表型探究
NAT10是RNA乙酰化酶,为了探究RNA乙酰化(ac4C)对RNA的结构和功能的影响。作者首先探究了NAT10的功能。在Hela细胞中,下调NAT10后,发现能够抑制细胞周期,抑制细胞的增殖能力(图D和E)。为了进一步探究NAT10的功能,作者在siNC和siNAT10转染的Hela细胞中做了RNA-seq,通过GO功能注释分析,发现差异mRNA与Hela细胞凋亡相关(图G),这与前面的细胞表型结果是一致的。

图1:NAT10在细胞和分子层面上功能探究
2)NAT10对mRNA ac4C修饰水平的影响
那么NAT10对mRNA ac4C修饰水平的影响是怎么样的呢?作者通过HPLC方法,发现下调NAT10能够明显降低mRNA ac4C的修饰水平(图D)。

图2:NAT10能够影响mRNA ac4C的整体水平
(2)找NAT10的下游靶基因
ac4C RNA-seq和RNA-seq联合分析:为了进一步探究NAT10对下调靶基因的调控,作者做了RNA 乙酰化测序(acRIP-seq)和RNA-seq,并进行生信分析
1)acRIP-seq结果展示
acRIP-seq测序方法(图A);统计显示有4,251个ac4C peaks(图E);ac4C peak峰主要分布在mRNA的CDS区(图H);靶mRNA的可视化结果,从左到右依次ac4C修饰高富集、中富集、无富集(图F)。

图3:acRIP-seq原理及部分生信分析结果
2)acRIP-seq和RNA-seq联合分析结果展示
火山图展示ac4C修饰随下调的靶基因影响比较明显(图B);并且ac4C修饰主要发生在下调靶mRNA的CDS区(图D);累计分数图展示CDS区能够明显靶基因的差异改变倍数(图E);这说明ac4C修饰主要发生在mRNA的CDS区。

图4:acRIP-seq和RNA-seq联合分析结果
ac4C修饰位点主要发生在mRNA CDS区,那么是不是影响mRNA的翻译呢?
(3)ac4C的功能探究
1)探究ac4C对mRNA的稳定性的影响
为了探究ac4C修饰对mRNA的稳定性的影响,作者做了BRIC-seq(主要用于检测RNA半衰期)。BRIC-seq原理图(图A);在WT中,ac4C修饰和CDS能够延长mRNA的半衰期,进一步说明能够提高mRNA的稳定性(图B);下调NAT10能够一直ac4C靶mRNA的稳定性(图C);作者又进一步通过BRIC-RT-qPCR低通量验证,ac4C靶mRNA的表达情况,发现下调NAT10能够明显抑制ac4C靶mRNA的稳定性,这与测序结果一致(图E)。


图5:ac4C修饰能够促进mRNA的稳定性
2)探究ac4C对mRNA的翻译效率的影响
为了探究ac4C修饰对mRNA的翻译效率的影响,作者做了Ribo-seq(核糖体测序)。Ribo-seq原理图(图B)。生信分析,在WT中,ac4C靶mRNA的的翻译效率增强,下调NAT10后,ac4C靶mRNA的翻译效率整体下降(图C)。qPCR结果显示,下调NAT10后,ac4C靶mRNA的RNA水平没有明显差异变化,但是在蛋白表达水平上是明显降低的(图D-F)。


图6:ac4C修饰能够促进mRNA的翻译效率
(4)ac4C的机制探究
那么,ac4C是如何调控mRNA翻译效率的呢?接下来作者进行了ac4C的分子机制探究。作者探究了mRNA密码子的偏好性,并通过生信分析展示了乙酰化修饰在第3位碱基上的情况(图A),并对其进行统计,发现乙酰化修饰的C出现在mRNA 密码子的第3位具有统计学意义(图B);motif分析结果显示在ac4C靶mRNA中的第3位碱基上,大多会出现发生乙酰化的C(图D-E)。
为了进一步进一步验证ac4C对mRNA翻译的影响,作者利用荧光素酶报告实验(图F),在报告质粒中转入发生修饰的C(ac4C(+))和同种突变的C(ac4C(—)),体外转录后,转入hela细胞中,分别用ac4C(+)和ac4C(—)激活剂,检测荧活性值,结果展示ac4C(+)能够显著提高mRNA的翻译效率(图G);裂解发生ac4C(+)和ac4C(—)mRNA后,检测荧光素活性值,发现 ac4C靶mRNA中C的摆动性百分比显著增强(图H)。



图7:ac4C通过密码偏好性促进mRNA的翻译效率
文章总结
本文总体架构分三步走:首先从NAT10(唯一的RNA乙酰化酶)出发,探究了酶的功能,发现下调NAT10能够抑制Hela细胞的增殖,下调mRNA ac4C修饰的整体水平;然后通过acRIP-seq和RNA-seq联合分析,发现ac4C修饰位点主要发生在mRNA的CDS区;最后探究了ac4C的功能机制,发现ac4C通过碱基偏好性促进mRNA的翻译效率。

图8:ac4C通过密码偏好性促进mRNA的翻译效率
云序acRIP-seq技术服务:
RNA乙酰化免疫共沉淀 (acetylated RNA Immunoprecipitation,acRIP) 技术:基于抗体特异性结合乙酰化修饰的碱基的原理,以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础,然后通过高通量测序,在全转录组范围内研究发生乙酰化的RNA区域,高效获得结果。   

图注:acRIP实验及生信分析流程图
云序acRIP-seq优势
分子全覆盖
可全面检测circRNA、LncRNA、mRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子ac4C乙酰化位点。
超微量技术
样本低至500ng
系统性解决方案
提供acRIP乙酰化测序、rip测序&RNA pulldown等全套技术服务,助力RNA乙酰化高分文章发表。
抗体富集效率高
acRIP-seq实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性。
严格的质控
acRIP-seq实验每一步骤均设有关键质控,全程监控实验质量,保证优质数据。
专业的生物信息学分析
云序生物拥有专业的生物信息分析团队,帮助客户进行实验数据的全面挖掘。
RNA甲基化测序与转录组联合应用
整合RNA乙酰化数据和转录组数据进行生物信息学关联分析,揭示RNA乙酰化对基因表达调控的影响,深入挖掘RNA乙酰化的功能。
acRIP-seq样品要求
样品类型
细胞、组织或RNA,其他样本类型及样品量请电询。
样品量 
       a)细胞:≥2×107
       b)组织:500mg - 1g
       c)  RNA:30μg - 300μg
       d) 超微量满足500ng - 30μg
云序生物RNA表观转录组学特色:
云序作为一家依托于高通量测序的表观转录组学科研服务公司,长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品,继m6A、m5C、m1A之后,云序隆重推出多款RNA新修饰,不仅ac4C RNA乙酰化测序,还包括m7G/m3C RNA甲基化测序、2'-氧-甲基化测序等产品,打造了全面的RNA修饰研究平台。
云序,您身边的表观转录测序专家!

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来源:上海云序生物科技有限公司
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